HOME  DIAGNOSTICA Elenco dei lavori disponibili

Ricerca della cocaetilene nei fluidi biologici: come e perchè

Letizia Antonilli e Paolo Nencini
Dipartimento di Fisiologia Umana e Farmacologia e Servizio Speciale Antidroga
Università di Roma "La Sapienza" e Policlinico Umberto I

Introduzione
L'assunzione combinata di alcol e cocaina, comportamento di poliabuso di sostanze psicoattive tra i più diffusi^(1,2), determina nell'organismo la formazione di un metabolita farmacologicamente attivo detto cocaetilene (estere etilico della benzoilecgonina: Fig 1). Gli studi condotti sull'uomo, volti a riprodurre, attraverso somministrazioni ripetute di cocaina ed alcol, l'usuale pattern d'abuso di queste due sostanze, hanno contribuito a comprendere sul piano farmacologico, gli elementi motivazionali che sono alla base di tale poliabuso e il ruolo che la cocaetilene assume nel rinforzare tale comportamento⁽³⁾.
L'assunzione di etanolo in associazione con la cocaina non solo ne prolunga e ne potenzia l'effetto euforizzante (high), ma produce anche un'amplificata percezione di benessere psicofisico ("feel good")⁽⁴⁾. Inoltre l'etanolo attenua lo stato disforico (crash) generalmente correlato con l'astinenza acuta da cocaina⁽⁵⁾. Mentre parte di questi effetti sono ascrivibili alle specifiche proprietà farmacologiche dell'etanolo e alla loro interazione con quelle della cocaina, recenti evidenze sperimentali indicano che la cocaetilene contribuisce direttamente con la sua attività farmacologica agli effetti precedentemente descritti^(6,7).
Il meccanismo farmacologico della cocaetilene è qualitativamente assimilabile a quello della cocaina nel bloccare il trasportatore della dopamina determinando quindi un'aumento delle concentrazioni extracellulari del mediatore in aree cerebrali di innervazione dopaminergica ritenute importanti per l'espressione del comportamento d'abuso (nucleus accumbens, ad esempio)^(8,9). La cocaetilene è invece molto meno attiva della cocaina sul trasportatore della serotonina⁽¹⁰⁾. Pertanto, mancando i meccanismi serotoninergici inibitori, la cocaetilene potrebbe indurre un maggior grado di euforia⁽¹¹⁾.
La cocaetilene ha una letalità maggiore della cocaina e gli effetti cardiotossici sono superiori a quelli della cocaina stessa^(12,13,14).
Una più ampia comprensione del ruolo farmacologico della cocaetilene è derivato dalle acquisizioni concernenti la biotrasformazione della cocaina in presenza di etanolo.

Fig.1 Trasformazione metabolica della cocaina

Effetti dell'etanolo sul metabolismo della cocaina
· formazione di cocaetilene
La rapida clearance della cocaina è in larga parte mediata dall'idrolisi del gruppo metilestere con formazione della benzoilecgonina, metabolita privo dell'attività psicoattiva posseduta dalla molecola precursore. Questa reazione è catalizzata da una carbossilesterasi aspecifica, con attività metilesterasica, identificata inizialmente nel tessuto epatico umano⁽¹⁵⁾ e successivamente purificata e caratterizzata dal punto di vista biochimico⁽¹⁶⁾. Studi in vitro realizzati utilizzando l'enzima purificato da fegato umano, hanno dimostrato che tale reazione, che avviene nella frazione microsomiale, è saturabile ad opera della cocaina e dell'etanolo⁽¹⁷⁾ e che quest'ultimo inibisce l'attività metilesterasica dell'enzima, diminuendo quindi l'idrolisi della cocaina a benzoilecgonina⁽¹⁸⁾. Inoltre in presenza di etanolo, la stessa carbossilesterasi catalizza la etiltransesterificazione della cocaina a cocaetilene.
Studi in vivo sull'uomo realizzati mediante somministrazione combinata di cocaina ed etanolo hanno portato alla definizione dei parametri farmacocinetici della cocaetilene. I risultati di tali osservazioni sperimentali relativi a elevati valori delle AUC e alla precoce comparsa di picchi di concentrazione del metabolita in specifiche sedi tissutali, quale quella epatica, renale e polmonare indicano che la formazione della cocaetilene avviene prevalentemente in questi organi con successiva distribuzione negli altri compartimenti tissutali⁽¹⁹⁾. In particolare, l'osservazione di una lenta eliminazione della cocaetilene dal tessuto cerebrale⁽²⁰⁾ spiegherebbe la prolungata azione euforizzante osservata in soggetti che abbiano assunto alcool e cocaina.
La formazione e l'accumulo della cocaetilene nel fegato, invece, è di potenziale interesse tossicologico. La cocaetilene, infatti, si trasforma, attraverso un processo di N-demetilazione, in norcocaetilene, molecola con elevata attività citotossica, come riportano osservazioni sperimentali condotte su colture di epatociti di ratto e umani^(21,22).
Concentrazioni plasmatiche di cocaetilene sono determinabili dopo circa 90 minuti dalla assunzione di cocaina ed etanolo, la sua emivita plasmatica è di circa 148 minuti, superiore quindi a quella della cocaina che è di 83 minuti⁽⁵⁾.
L'ipotesi che la formazione e l'accumulo di cocaetilene nell'organismo determini sia una alterazione delle risposte soggettive alla cocaina, sia una amplificazione dei suoi effetti tossici quando la droga viene assunta in combinazione con l'alcool, è indirettamente confermata dal fatto che la cocaetilene è stata identificata nelle urine, nel sangue, nel tessuto cerebrale e nel fegato di individui deceduti dopo esposizione acuta ad alcool e cocaina simultaneamente^(23,24,25). Inoltre la cocaetilene è stata riscontrata in campioni ematici di pazienti in stato di intossicazione acuta in seguito a ingestione di cocaina ed alcool^(4,8,25).

Determinazione della cocaetilene nei liquidi biologici
· considerazioni sulle tecniche analitiche adottate
In considerazione del crescente interesse rivolto alla cocaetilene per il suo potenziale contributo agli effetti tossici della cocaina, appare evidente l'importanza di poter disporre di tecniche analitiche dotate di un elevato grado di sensibilità, specificità e riproducibilità per la determinazione di tale molecola nei liquidi biologici.
A tal fine recentemente è stata messa a punto presso il nostro Laboratorio una tecnica cromatografica su strato sottile ad alta risoluzione (HPTLC) per la determinazione della cocaetilene nelle urine di pazienti tossicodipendenti⁽²⁶⁾. La procedura analitica è stata validata in termini di sensibilità, specificità, riproducubilità e linearità di risposta attraverso il confronto dei risultati ottenuti in HPTLC con quelli parallelamente forniti dalla cromatografia liquida ad alta risoluzione ( HPLC).
Per apprezzare il contributo dell'HPTLC nell'ambito della determinazione di farmaci e sostanze d'abuso e loro metaboliti nei liquidi biologici, è utile rilevare il tipo di informazioni analitiche che tale tecnica è in grado di fornire nonché la sua semplicità operativa, l'ampia automazione e i ridotti costi di gestione che ne permettono una utilizzazione routinaria nelle indagini tossicologiche. Rispetto alla tradizionale cromatografia su strato sottile comunemente conosciuta come TLC, la sua forma più attuale, l'HPTLC (high performance thin layer chromatography) appunto, utilizza fasi stazionarie caratterizzate da una granulometria estremamente ridotta e da geometria delle particelle molto omogenea.
Queste caratteristiche innovative hanno privilegiato l'obiettivo primario della separazione cromatografica, ovvero ottenere una risoluzione completa di composti strettamente correlati (selettività) con perdita minima della sensibilità dovuta a diffusione (efficienza).
Nel caso della tradizionale TLC la non omogeneità e le maggiori dimensioni delle particelle costituenti la fase stazionaria determinano ampie zone di diffusione sia nel punto di deposizione del campione che nella zona di migrazione dell'analita separato. Tutto ciò non può che influire negativamente sulla determinazione del fattore di ritenzione (Rf) che in cromatografia su strato rappresenta il parametro analitico di identificazione di una sostanza in riferimento ad un suo standard.
Questi vantaggi, prodotti dalle caratteristiche intrinseche della fase stazionaria, sono ancor più amplificati dalla possibilità di poter depositare i campioni in bande di dimensioni ridotte e regolari mediante un sistema automatico. La lastra viene quindi fatta sviluppare in camera orizzontale e al termine della corsa cromatografica le sostanze sono separate e concentrate in zone molto ridotte (bande). Il calcolo dell'Rf in tal modo risulta essere estremamente accurato e riproducibile. Inoltre la possibilità di collegare via software il sistema cromatografico con un densitometro in grado di operare, in un ampio intervallo di lunghezze d'onda, una scansione spettrofotometrica delle sostanze separate, rende possibile la loro identificazione attraverso un indice di correlazione tra lo spettro di assorbimento della sostanza e quello del suo standard di riferimento, garantendo quindi un risultato analitico altamente attendibile.
L'HPTLC, come del resto tutte le tecniche cromatografiche, richiede una serie di operazioni preliminari volte ad isolare il composto (o i composti) di interesse da altri componenti della matrice biologica. Tali procedure estrattive devono garantire il massimo recupero e la stabilità delle molecole da determinare.
Il problema della stabilità della cocaina e dei suoi metaboliti nei fluidi biologici rappresenta un fattore preanalitico di rilevante importanza legato alla possibilità che molecole con strutture di esteri degli acidi carbossilici, come appunto la cocaina e la cocaetilene, possano subire una idrolisi di tipo non enzimatico^(27,28,29). In ogni caso la concentrazione di cocaina in campioni ematici o urinari può essere stabilizzata se gli stessi sono preventivamente acidificati e trattati con gli inibitori delle pseudocolinesterasi, come i composti organofosforici, o più semplicemente con fluoruro di sodio (NaF) in ragione del 2%.
Per l'estrazione di tali molecole dalla matrice biologica attualmente vengono utilizzati i sistemi in fase solida (SPE) che hanno in larga misura sostituito la più tradizionale estrazione liquido-liquido per una serie di molteplici ragioni. Intervengono qui considerazioni riguardanti la diversa natura lipofila dei tre composti e la loro diversa costante di dissociazione (pKa). La benzoilecgonina è il composto che manifesta un maggiore carattere idrofilo, per la presenza della funzione carbossilica, rispetto alla cocaina e alla cocaetilene che sono chimicamente due esteri. I rispettivi pKa, infatti, risultano essere: per la cocaina 8.60; per la cocaetilene 8.23 e per la benzoilecgonina 5.48. A causa della natura idrofilica della benzoilecgonina, l'estrazione liquido-liquido richiederebbe per questa molecola l'impiego di alcol al fine di aumentare l'efficienza estrattiva.
Tuttavia, se l'alcol da una parte migliora il recupero della benzoilecgonina, dall'altra comporta la coestrazione di metaboliti endogeni tipicamente presenti nelle urine. Questo si tradurrebbe in un aumento del chemical backgroud noise che genera, in fase cromatografica, una serie di segnali interferenti con notevole riduzione della sensibilità, della riproducibilità e della risoluzione analitica⁽³⁰⁾. Inoltre un altro aspetto sfavorevole e non meno importante dell'uso di solventi alcolici è rappresentato dal fatto che tale uso non porterebbe ad una elevata percentuale di estrazione delle altre due molecole, cocaina e cocaetilene, che possiedono un carattere di maggiore liposolubilità.
L'estrazione in fase solida, pertanto, rappresenta una valida alternativa alla estrazione liquido-liquido in quanto l'estrazione degli analiti avviene non solo sulla base della loro diversa solubilità in un dato solvente estraente, ma anche sulla base di una selettiva interazione con una fase stazionaria.
Il sistema in fase solida adottato, con soddisfacenti risultati, nel presente studio utilizza una fase stazionaria definita mixed-phase, costituita da materiale non polare (octadecilsilice C₁₈) coniugato con uno scambiatore cationico forte. Gli analiti, pertanto, vengono fortemente trattenuti dal sorbente per una combinazione di interazioni coulombiane e idrofobiche; segue, quindi, una serie di procedure di lavaggio con solventi acquosi ed inorganici. In particolare, il campione biologico, portato a pH 6, è applicato alla colonna, precedentemente condizionata. La fase stazionaria, come già detto, contiene sia gruppi funzionali idrofobici (C₁₈) che gruppi a scambio cationico. In simili condizioni, composti con caratteristiche di acidi e basi deboli sono trattenuti dalle funzioni idrofobiche, mentre le basi protonate interagiscono con i gruppi a scambio cationico. Dopo il lavaggio con acqua e acidificazione con acidi diluiti (acido cloridrico, acido acetico, ecc.), l'eluizione differenziale degli analiti può essere realizzata con miscele di solventi organici, quali acetone:cloroformio (1:1) per la frazione acido-neutra, seguita da etilacetato, addizionato con ammoniaca, per la frazione basica. L'estrazione in fase solida con sorbenti mixed-phase ha portato ad un notevole miglioramento del clean-up del campione prima dell'analisi cromatografica ed inoltre le condizioni di moderato pH utilizzato hanno ridotto notevolmente il processo di idrolisi chimica della cocaina.

Obiettivo dello studio
Alla luce di quanto detto ci siamo posti l'obiettivo di introdurre nel protocollo delle indagini tossicologiche svolte dal nostro Laboratorio di Analisi, un metodo analitico versatile, specifico e sensibile, mirato alla identificazione della cocaetilene nei campioni urinari già risultati positivi al preliminare test immunochimico della cocaina. A tal fine sono stati valutati e confrontati i parametri analitici di base quali sensibilità, specificità, riproducibilità, linearità di risposta e accuratezza, relativamente a due tecniche di tipo cromatografico: la cromatografia su strato sottile ad alta risoluzione (HPTLC) e la cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC). Quindi, sono stati confrontati i risultati relativi ai valori di concentrazione urinaria di cocaina, cocaetilene e benzoilecgonina ottenuti mediante le due diverse applicazioni cromatografiche. Inoltre è stata calcolata l'efficienza, in termini di recupero quantitativo, del sistema di estrazione degli analiti dalla matrice biologica. Le varie fasi della validazione delle due procedure analitiche sono descritte in dettaglio nella successiva parte sperimentale.

Parte sperimentale

• Raccolta dei campioni
  I campioni urinari di sedici pazienti tossicodipendenti ricoverati presso il Policlinico Umberto I sono stati sottoposti ad un preliminare screening analitico mediante metodo imunoenzimaico (EMIT d.a.u. Syva, San Josè, CA, USA) per valutare la presenza di morfinici, metadone, cocaina, amfetamine, benzodiazepine e barbiturici. I campioni risultati positivi per la presenza dei metaboliti della cocaina sono stati quindi addizionati con NaF al 2% e conservati a - 20 °C sino alla successiva analisi in HPTLC e HPLC.
  
  
• Estrazione
  I campioni biologici sono stati sottoposti ad estrazione in fase solida utilizzando colonne LiChrolut TSC (Merck, Darmstad, Germany) secondo la procedura descritta da Clauwaert (30). Le colonne sono state inizialmente condizionate con metanolo (2x1 ml) e successivamente con tampone fosfato di potassio 0.1 M a pH 6.0. Quindi si è applicato il campione e si è proceduto al lavaggio, applicando in successione acqua, acido cloridrico 0.1 M, metanolo e acetonitrile al fine di allontanare gli interferenti della matrice. Infine gli analiti sono stati eluiti con una miscela di diclorometano:2-propanolo:ammoniaca al 25% nelle proporzioni rispettive di 80:20:2. L'eluato è stato evaporato sotto corrente di azoto a 37°C. Il residuo dell'evaporazione è stato ripreso in metanolo e sottoposto ad analisi in HPTLC ed HPLC come successivamente descritto.
  
  
• Cromatografia su strato sottile ad alta risoluzione (HPTLC)
  I campioni sono stati seminati su lastre di HPTLC 10x10 cm di gel di Silice 60F254 (Merck) mediante depositore automatico Linomat IV (CAMAG). Lo schema di semina normalmente adottato ha previsto la deposizione sulla lastra cromatografica di una miscela di tre standard: cocaina, benzoilecgonina, cocaetilene, in un intervallo di concentrazione compreso tra 10-500 ng al fine di realizzare una curva di calibrazione per ciascun composto.
  La separazione cromatografica è stata realizzata in una camera orizzontale, previa saturazione della stessa, utilizzando come fase mobile (31) una miscela di esano:toluene:dietilammina (65: 20: 5).
  Il cromatogramma è stato quindi sottoposto a scansione densitometrica in assorbanza- riflettanza a 234 nm. La valutazione quantitativa è stata realizzata attraverso una retta di regressione costruita correlando le altezze o le aree dei picchi degli standard con le loro concentrazioni.
  L'identificazione delle sostanze separate è stata realizzata sia attraverso il calcolo del fattore di ritenzione (Rf) che mediante l'analisi dello spettro di assorbimento, nell'intervallo di lunghezze d'onda compreso tra 180 e 400 nm, e il confronto dello stesso con quello degli standard di cocaina, cocaetilene e benzoilecgonina. L'indice di correlazione spettrale calcolato ha fornito il grado di identità attribuibile a ciascuna sostanza separata. I dati soso stati processati e memorizzati mediante un appropriato software di gestione analitica (Cats3, versione 3.20 Camag).
  
  
• Cromatografia liquida ad alta risoluzione ( HPLC )
  L'analisi HPLC è stata condotta con un sistema analitico Merck-Hitachi. La separazione di cocaina, benzoilecgonina e cocaetilene è stata realizzata su colonna LiChrospher 100 RP-18 (5mm) Merck in condizioni di gradiente lineare⁽³⁰⁾.
  La fase mobile, rappresentata dagli eluenti A e B costituiti rispettivamente da acqua:metanolo:acetonotrile (80:10:10) e da metanolo:acetonitrile:acqua (40:40:20), è stata applicata alla colonna ad un flusso di 1 ml/min.
  L'eluato è stato monitorato a 235 nm mediante un detector UV-diode array e gli spettri sono stati raccolti nell'ambito di lunghezza d'onda compreso tra 220 e 400 nm. L'identità di ciascun composto è stato stabilito per confronto dei tempi di ritenzione (RT) e degli spettri di assorbimento dei campioni con quelli ottenuti dopo iniezione degli standards, compresi in un intervallo di concentrazione tra 25 e 5000 ng/ml. La valutazione quantitativa è stata realizzata attraverso una retta di regressione costruita correlando le altezze o le aree dei picchi degli standard con le loro concentrazioni.

Risultati
Lo screening immunoenzimatico ha indicato la presenza di metaboliti della cocaina in 16 campioni urinari. La identificazione e la determinazione quantitativa della benzoilecgonina, cocaina e cocaetilene in tali campioni è stata effettuata parallelamente mediante HPTLC e HPLC. I risultati analitici ottenuti sono stati confrontati per quanto riguarda sensibilità, linearità, precisione e accuratezza.

• HPTLC
  L'analisi cromatografica su strato sottile ad alta risoluzione, condotta secondo le condizioni precedentemente descritte, ha portato ad una efficiente separazione della cocaina, benzoilecgonina e cocaetilene con valori di Rf rispettivamente pari a 0.02, 0.36, e 0.44. Il limite di sensibilità è risultato essere pari a 0.5 e 1.0 µg/ml per ciascun composto. Le curve di calibrazione sono apparse lineari nell'intervallo compreso tra 10 e 500 ng con un cofficiente di correlazione pari a 0.9995. L'analisi spettrale delle sostanze separate e dei relativi standard di riferimento ha fornito un coefficiente di correlazione pari a 0,9998 a conferma della assoluta identità di ciascun analita. La purezza dei profili spettrali, inoltre, indica il soddisfacente clean up del campione ottenuto con il sistema di estrazione precedentemente descritto.
  
  
• HPLC
  L'analisi effettuata mediante cromatografia liquida ha condotto ad una efficiente separazione della cocaina, della benzoilecgonina e della cocaetilene con valori di RT rispettivamente pari a 8.48, 14.8 e 17.01 minuti. Le curve di calibrazione dei tre composti sono risultati essere nell'intervallo di concentrazione compreso tra 25 e 5000 ng/ml. Il limite di sensibilità corrispondeva a 0.1 µg/ml.
  
  
• Confronto tra HPTLC e HPLC
  Le concentrazioni urinarie della cocaina, cocaetilene e benzoilecgonina ottenute mediante le due metodiche cromatografiche sono riportate in tabella 1. L'analisi della regressione lineare di tali risultati indica un'eccellente correlazione tra le due tecniche analitiche con valori di r (coefficiente di correlazione) pari a 0.99, 0.92 e 0.99, per benzoilecgonina, cocaetilene e cocaina, rispettivamente.

Conclusioni
I risultati ottenuti dalle nostre osservazioni hanno evidenziato la possibilità di poter introdurre nell'abituale "screening" di indagine tossicologica eseguito dal nostro Servizio un test analitico di tipo cromatografico per l'identificazione e la determinazione della cocaetilene nei campioni biologici.
Sia la cromatografia su strato sottile ad alta risoluzione (HPTLC) sia la cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) soddisfano pienamente i criteri di semplicità operativa, riproducibilità, sensibilità e specificità richiesti per le determinazioni analitiche di interesse clinico-tossicologico.
Le differenze nei limiti di sensibilità delle due metodiche, corrispondenti a 1.0 µg/ml per l'HPTLC e 0.1µg/ml per l'HPLC, suggeriscono l'opportunità di riservare all'HPLC una scelta elettiva in tutti i casi in cui l'indagine analitica riguardi la determinazione di basse concentrazioni di cocaetilene, ad esempio in studi farmacocinetici dove può interessare l'andamento delle concentrazioni plasmatiche di cocaetilene anche durante la fase di eliminazione della sostanza o quando si ricerchino tracce della stessa.
Nei casi in cui la cocaetilene è presente a concentrazioni maggiori, come ad esempio nei campioni urinari, l'HPTLC può essere vantaggiosamente utilizzato, offrendo il vantaggio di una riduzione dei tempi di analisi. Ciò è dovuto al fatto che nel caso dell'HPTLC non sono previste le fasi di rigenerazione e condizionamento della colonna analitica e nel contempo vengono assicurate le condizioni di specificità, caratteristica intrinseca del sistema di rivelazione UV-diode array.
Questa evenienza è particolarmente vantaggiosa quando l'indagine tossicologica è finalizzata, come nel caso della determinazione della cocaetilene, alla ricerca di metaboliti delle "droghe d'abuso" che altrimenti non potrebbero essere identificati con le usuali tecniche immunochimiche a causa del limite di cross-reactivity di queste ultime.
L'introduzione della determinazione della cocaetilene nel protocollo analitico di un laboratorio chimico-tossicologico ha un evidente interesse sul piano clinico. Infatti, la presenza nei campioni biologici del suddetto metabolita rappresenta un "marker" analitico-diagnostico estremamente utile nell'evidenziare, in soggetti che assumono cocaina, la concomitante assunzione di alcool, comportamento questo assai diffuso di "poliabuso" di sostanze psicoattive.
Un ulteriore ragione d'interesse nello sviluppo di metodiche semplici ed efficienti di determinazione della cocaetilene deriva dalla proposta di utilizzare la cocaetilene come farmaco anticraving nel cocainismo^(3,32) In tal caso l'accertamento della compliance al trattamento terapeutico richiede una metodica che permetta la discriminazione tra cocaina e cocaetilene, obiettivo non conseguito dalle metodiche di screening attualmente in uso.

Bibliografia

1. Grant B.F., Harford T.C. Concurrent and simultaneous use of alcohol with cocaine: Results of a national survey. Drug Alcohol Depend. 1990; 25:97-104
2. Rounsaville B.J., Anton S. F., Carrol K., Budde D., Prusoff B.A., Gavin F. Psychiatric diagnoses of treatment-seeking cocaine abusers. Arch. Gen. Psychiatry. 1991; 48:43-511.
3. Hart C.L., Jatlov P., Sevarino K.A., McCance-Katz E.F. Comparison of intravenous cocaethylene and cocaine in humans. Psychopharmacology. 2000; 149: 153-162.
4. Jatlow P., Elsworth J.D., Bradberry C.W., Winger G., Taylor J. R., Russel R., Roth R.H. Cocaethylene: a neuropharmacologically active metabolite associated with concurrent cocaine-ethanol ingestion. Life Sci. 1991; 48: 1787-1794.
5. Mc Cance-Katz E.F., Price L.H., Mc Dougle C.J., Kosten T.R. Black J.E. Jatlow P. Concurrent cocaine-ethanol ingestion in humans: pharmacology, physiology, behavior, and the role of cocaethylene. Psychopharmacology 1993; 111: 39-46.
6. Perez-Reyes M., Jeffcoat R.A. Ethanol/cocaine interaction: cocaine and cocaethylene plasma concentrations and their relationship to subjective and cardiovascular effect. Life Sci. 1992; 51: 553-563.
7. Cami J., Farre M., Gonzles M.L.; Segura J., de la Torre R.: Cocaine metabolism in humans after use of alcohol. Clinical and research implications. Recent Dev. Alcohol. 1998;14:437-455.
8. Hearn W. L., Flynn D.D., Hime G.W., Rose S., Cofino J.C., Mantero-Atienza E. Cocaethylene: a unique cocaine metabolite displays high affinity for the dopamine transporter. J. Neurochem. 1991; 56: 698-701.
9. Bunney E.B., Appel S.B., Brodie M.S. Electrophysiological effects of cocaethylene, cocaine and ethanol on dopaminergic neurons of the ventral tegmental area. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2001; 297: 696-703.
10. Bradberry C.W., Murphy E., Nobiletti J., Jatlow P., Roth R.H. Cocaine and cocaethylene: microdialisys comparison of brain drug levels and effects on dopamine and serotonin. J. Neurochem. 1993; 60: 1429-1435.
11. Walsh S.L., Cunningham K.A. Serotonergic mechanism involved in the discriminative stimulus, reinforcing and subjective effects of cocaine. Psychopharmacology 1997;130:41-58.
12. Perez-Reyes M.: Subjective and cardiovascular effects of cocaine and cocaethylene in humans. Psychopharmacology 1993;113: 144-147.
13. Schechter M.D., Meehann S.M. The lethal effects of ethanol and cocaine and their combination in mice: implications for cocaethylene formation. Pharmacol. Biochem. Behav. 1995;52: 245-248.
14. Wilson L.D., Jeromin J., Garvey L., Dorbandt A.: Cocaine, ethanol and cocaethylene cardiotoxity in an animal model of cocaine and ethanol abuse. Acad. Emerg. Med. 20018: 211-222.
15. Dean R.A., Christian C.D., Sample R.H.B., Bosron W.F. Human liver cocaine esterases: ethanol-mediated formation of ethylcocaine. Faseb J. 1991; 5: 2735-2739
16. Brzezinski M.R., Abraham T.L., Stone C.L., Dean R.A., Bosron W.F. Purification and characterization of human liver cocaine carboxylesterase that catalyzes the production of benzoylecgonine and formation of cocethylene from alcohol and cocaine. Biochem. Pharmacol. 1994; 48: 1747-1755.
17. Boyer C.S., Peterson D.R.: Enzymatic basis for the transesterification of cocaine in the presence of ethanol: evidence for participation of microsomal carboxylesterases. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1992; 260: 939-946.
18. Roberts S.M., Habison R.D., James R.C. Inhibition by ethanol of the metabolis of coaine to benzoylecgonine and ecgonine methyl ester in mouse and human liver. Drug Metab. Dispos. 1993; 21: 537-541.
19. Dean R.A., Harper E.T., Dumaual N. Effects of ethanol on cocaine metabolism: formation of cocaethylene and norcocaethylene. Toxicol. Appl. Pharmacol. 1992; 138: 41-56.
20. Volkow S.L. Cunnigham K.A. Brain-imaging studies of the combined use of cocaine and alcohol and of the pharmacokinetics of cocaethylene. NIDA Res. Monogr. 1994; 138: 41-56.
21. Boelsterli U.A., Wolf A., and Goldlin C. Oxigen free radical production mediated by cocaine and its ethanol-derived metabolite, cocaethylene, in rat hepatocytes. Hepatology 1993; 18: 1154-1161.
22. Ponsoda X., Bort R., Jover R. Increased toxicity of cocaine on human hepatocytes by ethanol: role of GSH. Biochem. Pharmacol. 1999; 58:1579-1585.
23. Bailey D.N. Plasma cocaethylene concentrations in patients treated in the emergency room or trauma unit. Am.J.Clin. Pathol. 1993; 99:123-127.
24. Kalasinsky K.S., Bosy T.Z., Adam S.V., Gores. B., Kishs. J.: Regional distribution of cocaine in postmortem brain of chronic human cocaine users. J. Forensic. Sci. 2000; 45:1041-1048.
25. Machey-Bojack S., Kloss J., Apple F. Cocaine, cocaine metabolite and ethanol concentrations in postmortem blood and vitreous humor. J. Anal. Toxicol. 2000; 24:59-65.
26. Antonilli L., Suriano C., Grassi M.C., Nencini P. Analysis of cocaethylene, benzoylecgonine and cocaine in human urine by high-performance thyn layer chromatography with ultraviolet detection: a comparison with high-performance liquid chromatography. J.Chromatogr. B Biomed. Appl. 2001; 751:19-27.
27. Brogan W.C., Kemp P.M., Bost R.O.: Collection and handling of clinical blood samples to assure the accurate measurement of cocaine concentration. J. Anal. Toxicol. 1992; 16: 152-154.
28. Baselt R.C., Yoshikawa D., Chang J.: Improved long-term stability of blood cocaine in evacuated collection tubes. J. Forensic Sci. 1993; 38: 935-937.
29. Isenschmid D.S., Levine B.S. and Caplan Y.H. A comprehensive study of the stability of cocaine and its metabolites. J. Anal. Toxicol. 1989; 13:250-256.
30. Clauwaert K.M., van Bocxlaer J.F., Lambert W.E.: Liquid chromatographic determination of cocaine, benzoylecgonine, and cocaethylene in whole blood and serum samples whit diode-array detection. J. Chromatogr. 1997; 35:321-328.
31. Bailey D.N. Thin-layer chromatographic detection of cocaethylene in human urine. Am. J. Clin. Pathol. 1994; 101: 342-345.
32. Bradberry C.W., Lee T., Jatlov P. Rapid induction of behavioral and neurochemical tolerance to cacaethylene, a model compound for agonist therapy of cocaine dependence. Psychopharmacology 1999; 146:87-92.

Tabella 1: Concentrazioni di benzoilecgonina, cocaina e cocaetilene in campioni urinari risultati positivi allo screening immunoenzimatico.

Concentrazioni (µg ml-1)
N° pazienti.	BE		CO		CE
	HPTLC	HPLC	HPTLC	HPLC	HPTLC	HPLC
1	7.03	6.68	1.53	1.46	1.72	1.58
2	7.15	6.94	8.7	8.42	10.89	10.54
3	4.15	3.97	< 1.0	0.04	< 1.0	< 0.1
4	1.87	1.93	< 1.0	< 0.2	< 1.0	< 0.1
5	1.91	1.72	1.59	1.47	1.62	1.56
6	1.68	1.75	< 1.0	< 0.2	1.51	1.44
7	1.79	1.95	1.32	1.25	< 1.0	< 0.1
8	2.58	2.35	1.18	1.26	< 1.0	< 0.1
9	3.48	3.56	1.87	1.85	1.95	1.87
10	2.54	2.36	1.05	0.92	< 1.0	0.32
11	5.92	5.74	1.29	1.21	3.85	3.71
12	2.85	3.28	2.3	1.25	< 1.0	< 0.1
13	9.32	8.58	< 1.0	0.52	< 1.0	< 0.1
14	11.45	12.38	4.25	4.36	5.14	6.25
15	4.12	4.36	< 1.0	0.89	2.68	2.85
16	7.89	8.56	1.15	1.02	< 1.0	< 0.1
Media±	4.73	4.75	2.36	1.85	3.67	3.31
SD	± 3.03	± 3.12	± 2.29	± 2.12	± 3.18	± 3.23
r	0.99		0.92		0.99

Abbreviazioni usate: Be = benzoilecgonina, CO = cocaina, CE = cocaetilene
r = coefficiente di correlazione